Tomasz Bieńkowski

Laboratorium Masdiag
strony wersji drukowanej: 50-55



Pod koniec XX wieku rozpoczął się projekt poznania ludzkiego genomu (Human Genom Project). Zakończył się on w 2003 roku. Środowisko naukowe wiązało z nim wielkie nadzieje, związane szczególnie z diagnozowaniem chorób. Niestety, nie do końca się one spełniły. W wielu przypadkach na podstawie badań genetycznych można zdiagnozować wybrane choroby, ale w jeszcze większej ilości przypadków okazało się, że genom wskazuje na predyspozycje danego organizmu, natomiast o faktycznym stanie organizmu więcej może powiedzieć metabolomika, proteomika, lipidomika i glikomika czyli nauki, które zajmują się przemianami i stanem metabolitów oraz różnych grup biocząsteczek. W dziedzinach tych spektrometria mas ma wiele zastosowań. W poniższym artykule zostaną zaprezentowane wybrane zagadnienia dotyczące zastosowania spektrometrii mas w proteomice.

Pierwszym zastosowaniem spektrometrii mas w proteomice była identyfikacja białek. Istnieją dwie strategie identyfikacji, z góry na dół (top down) czyli analiza sekwencji dla całych białek oraz z dołu do góry (buttom-up), w której badane białko trawi się enzymatycznie i analizę przeprowadza się na poziomie peptydów. Na podstawie oznaczonych peptydów rozpoznaje się białko. Peptydy identyfikuje się głównie na podstawie widm fragmentacyjnych przy użyciu bibliotek składających się z sekwencji białek. Prowadzi się również próby analizy z góry na dół na różnorodnych typach spektrometrów, ale jak na razie strategia ta nie zdobyła zbyt dużej popularności. Zdecydowanie więcej pomiarów prowadzi się stosując metodę z dołu do góry, zarówno przy identyfikacji czystych białek (np. plamek z żeli dwuwymiarowych), jak i skomplikowanych mieszanin. W przypadku czystych białek lub mieszanin kilku białek identyfikację można prowadzić za pomocą MALDI TOF/TOF lub za pomocą tandemowych systemów LC/MS/MS. Natomiast bardziej złożone mieszaniny białek można identyfikować za pomocą wysokorozdzielczych systemów LC/MS/MS typu QqTOF lub Orbitrap. W zależności od tego jak bardzo skomplikowana jest mieszanina pierwszym krokiem jest trawienie enzymatyczne. Następnie wykonuje się bezpośrednią analizę LC/MS/MS lub stosuje się wstępne frakcjonowanie próbki. W czasie analizy wykonywane jest widmo MS wysokiej rozdzielczości, a następnie, dla zdefiniowanej ilości najwyższych sygnałów pochodzących od peptydów (od 10 do 50 w zależności od typu mieszaniny i rodzaju spektrometru mas), wykonywane są widma fragmentacyjne. Podczas analizy trwającej do kilku godzin możliwa jest identyfikacja kilku tysięcy białek. Metoda ta ma bardzo duży potencjał, ale do uzyskania jak najlepszych wyników potrzebny jest czuły spektrometr charakteryzujący się dużą szybkością zbierania danych w trybie MS/MS. Największym ograniczeniem tej metody jest jej niska powtarzalność, szczególnie dla białek o małym stężeniu. Kluczowym etapem jest wybór jonów, dla których zostanie wykonane widmo fragmentacyjne. W zależności od pomiaru różne jony dają najwyższe wygnały w widmie MS i dla różnych peptydów wykonywane są widma fragmentacyjne. Szacuje się, że powtarzalność tego typu pomiarów wynosi około 60%.

Identyfikacja białek w dalszym ciągu jest jednym z popularniejszych zastosowań spektrometrii mas, ale coraz częściej wykorzystuje się tą technikę do badania struktury białek i do analizy ilościowej.

Jedną z metod badania trzecio- i czwartorzędowej struktury białka jest mierzenie stopnia wymiany wodoru na deuter HDX (Hydrogen Deuter Exchange) przy pomocy spektrometrii mas. Pomiary wykonuje się umieszczając badane białko w roztworze deuterowanej wody D₂O w kontrolowanych warunkach. Następuje wymiana wodoru na deuter, a po zatrzymaniu reakcji wymiany poprzez obniżenie pH do 2,5 i obniżenie temperatury do 0^oC wykonuje się pomiar LC/MS/MS na spektrometrze wysokiej rozdzielczości. Widmo można wykonywać dla cząsteczki białka lub po szybkiej hydrolizie pepsyną na poziomie peptydowym. W cząsteczkach białka istnieją 3 grupy atomów wodoru. Pierwsza grupa to atomy związane z atomami węgla. Wiązanie węgiel wodór jest bardzo trwałe i wymiana wodoru na deuter jest zbyt wolna, żeby ją zaobserwować. Kolejna grupa to atomy wodoru występujące w grupach funkcyjnych, związane z atomem azotu lub tlenu (-NH₃, -OH, -COOH). Wymiana tych atomów jest z kolei bardzo szybka i w momencie, gdy reakcja jest zatrzymywana w roztworach zawierających H₂O, atomy deuteru wymieniane są z powrotem na atomy wodoru. Ostatnią grupę stanowią atomy wodoru związane z amidowym atomem azotu w wiązaniu peptydowym. Szybkość ich wymiany zależy od pH (najwolniejsza jest przy wartość około 2,6) oraz od temperatury. Na szybkość wymiany ma również wpływ położenia grup amidowych. Grupy, które znajdują się na zewnątrz struktury białka i do których cząsteczki rozpuszczalnika mają lepszy „dostęp” ulegają wymianie szybciej, natomiast te, do których cząsteczki rozpuszczalnika nie mają dostępu nie ulegają wymianie. Ponieważ deuter ma masę atomową o 1 większą niż wodór, po wymianie H/D masa cząsteczkowa całego białka wzrasta proporcjonalnie do ilości wymienionych atomów. Porównując wyniki pomiaru przed i po wymianie wodoru na deuter w przypadku analizy całych cząsteczek białka uzyskuje się informację ile atomów wodoru zostało wymienionych, a dla pomiarów na poziomie peptydowym uzyskuje się informacje, w których peptydach i ilu atomów wodoru nastąpiła wymiana, dzięki czemu można stwierdzić, które fragmenty sekwencji białka znajdują się na zewnątrz struktury.

HDX wykorzystuje się do badania różnorodnych właściwości białek. Najważniejsze to:

Badanie interakcji białek z ligandami lub innymi białkami. Pomiar masy cząsteczkowej wykonuje się dla wolnego białka, dla białka związanego z ligandem, z różnymi ligandami lub w różnych warunkach pH. Po przyłączeniu ligandu dostęp dla cząsteczek D₂O do miejsc, w których wiąże się ligand zmniejsza się. W zależności od siły wiązania ligandu do białka i ilości miejsc oddziaływania, różna ilość atomów wodoru zostaje wymieniona na deuter. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat miejsca wiązania ligandu, po zatrzymaniu reakcji wymiany, należy poddać cząsteczkę białka hydrolizie pepsyną i pomiary wykonać na poziomie peptydowym. Porównując stopień wymiany H/D przed i po związaniu ligandu można stwierdzić, które fragmenty sekwencji białka odpowiedzialne są za jego wiązanie.

HDX wykorzystuje się również do badania wpływu pH na zmianę konformacji białek. W tym wypadku pomiary są trochę bardziej skomplikowane, ponieważ szybkość wymiany H/D przy wiązaniu amidowym również zależy od pH. Projektując więc doświadczenia, w których zamierza się badać wpływ pH na konformację, należy zmodyfikować czasy prowadzenia wymiany w zależności od pH (Coales SJ, E SY, Lee JE, Ma A, Morrow JA, Hamuro Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid communications in mass spectrometry : RCM. 2010;24(24):3585-92.).

HDX wykorzystuje się ponadto do mapowania epitopów, badania agregacji białek, wpływu mutacji na zmianę konformacji. W wielu wypadkach oprócz relatywnie prostych eksperymentów sprawdzających stopień wymiany H/D przeprowadza się doświadczenia, w których bada się kinetykę procesu wymiany. W porównaniu do techniki NMR zastosowanie spektrometrii mas do mierzenia HDX umożliwia pracę z mniejszą ilością białek, wykonywanie pomiarów dla większych cząsteczek oraz w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Za pomocą spektrometru mas wykonuje się pomiary masy białek i peptydów, jak również widma fragmentacyjne. Wykonując analizy peptydów możliwe jest tylko ustalenie ile atomów wodoru w cząsteczce zostało wymienionych na deuter. Wskazanie, w których wiązaniach peptydowych nastąpiła wymiana nie jest możliwe poprzez wykonanie widma fragmentacyjnego (CID, collision induced dissociation) w komorze zderzeń, ponieważ ponieważ w trakcie tego procesu następuje wymiana atomów wodoru między poszczególnymi wiązaniami.

Aby możliwe było uzyskanie powtarzalnych i znaczących wyników HDX za pomocą spektrometru mas spełniony musi być szereg warunków. Najważniejsze to takie, że zarówno próbki jak i kolumna chromatograficzna muszą mieć możliwość utrzymywania ich w temperaturze 0oC oraz wymagane jest przeprowadzenie szybkiej hydrolizy enzymatycznej pepsyną. W obecnej chwili istnieją komercyjne rozwiązania umożliwiające wykonywanie pomiarów LC/MS/MS. Jeśli chodzi o przygotowanie próbek i sam proces wymiany H/D liderem jest firma Leap Technologies, która dostarcza gotowe do użytku rozwiązania. Do wykonania pomiarów MS i MS/MS potrzebny jest tandemowy spektrometr wysokiej rozdzielczości.

Kolejnym krokiem po identyfikacji białek jest opracowanie metody ilościowego profilowania białek. W przypadku analizy wybranych białek, kiedy analizowanych jest od kilku do kilkudziesięciu peptydów, spektrometry typu potrójny kwadrupol i tryb MRM mogą być wykorzystywane. Tryb MRM (Multiple Reaction Monitoring) jest charakterystyczny dla potrójnego kwadrupola. W pierwszym kwadrupolu w sposób ciągły wybierane są jony o zdefiniowanej wartości m/z. W komorze zderzeń następuje wysokoenergetyczna i wydajna fragmentacja, a drugi analizator kwadrupolowy przepuszcza tylko fragmenty o zdefiniowanej wartości m/z. W ten sposób badany związek rozpoznawany jest na podstawie reakcji fragmentacji. Możliwe jest zbudowanie metody ilościowej zawierającej około 1000 przejść MRM. Aby zwiększyć pewność pomiaru, dla jednego peptydu obserwuje się zazwyczaj kilka przejść MRM, dla jednego białka obserwuje się kilka do kilkunastu peptydów. Daje to możliwość analizowania kilkunastu białek w pojedynczym pomiarze. Wyzwaniem jest wykonanie takiego pomiaru w bardzo skomplikowanej matrycy lub dla dużo większej ilości białek. W przypadku wykonywania pomiarów ilościowych LC/MS/MS białek w skomplikowanej matrycy, np. analiza PSA (antygen sterczowy) w surowicy, pomiar prowadzi się na poziomie peptydowym. Szacuje się, że w surowicy znajduje się około 1 miliona białek i peptydów. Po przeprowadzeniu trawienia trypsyną powstaje niezwykle skomplikowana mieszanina i ryzyko interferencji dla wybranych do pomiarów przejść MRM jest bardzo duże z powodu ilości peptydów w badanej próbce oraz podobnego sposobu fragmentacji peptydów. Dlatego też rozwiązaniem wydaje się stosowanie trybu MRM3, dostępnego na spektrometrach typu QTRAP. Jest to tryb, który polega na dwukrotnej fragmentacji.W pierwszym etapie wybierane są jony macierzyste, a następnie do fragmentacji wybierany jest jeden z powstałych fragmentów. W ten sposób peptyd rozpoznawany jest na podstawie dwukrotnej reakcji fragmentacji, co bardzo zwiększa selektywność.

Kolejnym, wspomnianym wcześniej, wyzwaniem jest profilowanie wielu białek równocześnie. Kiedy chcemy sprawdzić jak zmienia się proteom badanego organizmu pod wpływem danego czynnika, spektrometry typu potrójny kwadrupol nie są wstanie sprostać temu zadaniu. Aby wykonać powtarzalną analizę ilościową w skomplikowanej mieszaninie, wymagane jest wykonanie widma MS/MS dla wszystkich badanych związków. Taką możliwość daje nowa metodyka wykonywania pomiarów – SWATH. Jest to pomiar wykonywany na spektrometrze typu QqTOF, ponieważ niezbędna jest wysoka rozdzielczość i szybkość wy konywania pomiaru. Dodatkowo, czym większa jest czułość pomiaru, tym więcej związków można badać. W dużym uproszczeniu strategia pomiaru polega na podzieleniu zakresu mas prekursorów na przedziały w zakresie 25 m/z. Wszystkie jony macierzystego z tego zakresu są następnie fragmentowane i tworzone jest widmo fragmentacyjne wysokiej rozdzielczości. Widma fragmentacyjne wykonywane są po kolei dla wszystkich przedziałów dla całego zdefiniowanego zakresu mas w sposób cykliczny. W ten sposób zbierane są widma fragmentacyjne dla wszystkich jonizujących się substancji. Dodatkowo pomiędzy cyklami widm fragmentacyjnych wykonywane jest widmo MS wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1).

Jako wynik pomiaru całej metody otrzymywany jest bardzo skomplikowany zbiór danych, ponieważ dla każdego zdefiniowanego przedziału wykonywana jest fragmentacja bardzo wielu związków. Jednakże, gdy chcemy sprawdzić czy w próbce znajdował się interesujący nas związek wystarczy wybrać odpowiedni przedział (np. dla peptydu o jonie 2- krotnie naładowanym o m/z 615 będzie to przedział 600 – 625 m/z), w którym powinien znajdować się jon macierzysty i wykonać chromatogram dla specyficznych dla tego związku jonów fragmentacyjnych XIC (Extracted Ion Chromatogram) (Rysunek 2).

XIC wykonywane są przy wykorzystaniu dokładnego pomiaru masy z szerokością zakresu 0,01 amu. W wyniku takiej operacji otrzymuje się kilka chromatogramów o wyglądzie zbliżonym do przejść MRM dla wszystkich jonów fragmentacyjnych badanej substancji. Pokrywają się one przy czasie występowania tej substancji. Z symulacji przeprowadzonych dla proteomu drożdży wynika, że selektywność tak zdefiniowanego obserwowania reakcji fragmentacji (25 amu pierwszym analizatorze masy i 0,01 amu w drugim) jest zbliżona do selektywności trybu MRM w potrójnym kwadrupolu (standardowo jest to 0,7 amu dla obu analizatorówmasy). Jednakże przy tak prowadzonym pomiarze nie definiujemy tych przejść przed pomiarem. Wykonywane są one dla wszystkich jonizujących się substancji w próbce. Możliwa jest więc względna analiza ilościowa tysięcy a nawet dziesiątków tysięcy substancji. Warunkiem jest znajomość fragmentacji badanej substancji. Wykonując więc takie pomiary w przypadku próbek proteomicznych, pierwszym etapem jest identyfikacja białek i stworzenie biblioteki peptydów znajdujących się w próbce. Aby zwiększyć ilość zidentyfikowanych związków analizę taką można wykonać wielokrotnie. Dodatkowo w przypadku gdyby dany związek nie został zidentyfikowany, a w wyniku innych doświadczeń lub danych literaturowych okazało się, że dana substancja może się znajdować w analizowanej za pomocą metodyki SWATH próbce, istnieje możliwość sprawdzenia czy rzeczywiście się tam znajdowała. Metodyka SWATH umożliwia więc względną analizę ilościową (profilowanie) bardzo dużej ilości związków oraz tworzy cyfrowy zapis składu próbki i umożliwia retrospektywną analizy danych.

Jeśli zainteresował Państwa temat i chcą Państwo uzyskać więcej informacji zachęcam do kontaktu:

tomasz.bieńTen adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript.

Marta Cyman

Gdański Uniwersytet Medyczny
strony wersji drukowanej: 42-48


Oznaczanie rodzaju i stężenia białek w materiale biologicznym jest jednym z najbardziej podstawowych oznaczeń wykonywanych w laboratoriach medycznych i naukowych. Efektywne badania białek są istotne nie tylko w przypadku materiału klinicznego pochodzącego od pacjentów ale także w pracach naukowych. Właśnie w ramach prac badawczych są opracowywane, udoskonalane i zatwierdzane nowoczesne metody oznaczania białek. Postęp technologii i „głód“ wiedzy wymaga stosowania bardziej wysublimowanych technik niż podstawowe metody kolorymetryczne i strąceniowe. Niniejszy artykuł ma na celu przegląd kilku najbardziej znanych współczesnych metod identyfikacji białek i pomiaru ich stężenia. Obecnie w diagnostyce medycznej część tych metod jest stosowana rutynowo, jednak nie na masową skalę i nie we wszystkich ośrodkach leczniczych.

W organizmie ludzkim białka odpowiedzialne są zarówno za podstawowe funkcje życiowe jak i za przeprowadzanie złożonych reakcji. W samym osoczu ludzkim występuje ponad 700 rodzajów białek. Powstające na matrycy mRNA białka są ostatecznym produktem ekspresji genów, czyli wyrazem aktywności danej sekwencji genomu. Jednak nie zawsze można postawić znak równości pomiędzy ilością mRNA i ilością powstającego w procesie translacji białka. Spowodowane jest to występowaniem etapu obróbki potranslacyjnej, podczas którego dochodzi do modyfikacji właściwości chemicznych i fizycznych białka, jego aktywności i stabilności oraz w konsekwencji także pełnionej funkcji. Może to prowadzić do powstawania kilku rodzajów białek z tej samej matrycy DNA. Analiza ludzkiego genomu dostarcza informacji jedynie o rodzaju kodowanych białek. Wciąż nieznane są wszystkie modyfikacje jakim one ulegają, ich funkcje oraz oddziaływania między nimi i w konsekwencji mechanizmy działania komórek, tkanek, organów, układów i całego organizmu człowieka. Nauka zajmująca się białkami w kontekście stworzenia proteogramu to proteomika. Rozwój tej dziedziny był możliwy dzięki dostępności szeregu metod analizy białek, których część zostanie krótko omówiona w niniejszym artykule.

Metoda Western blot jest techniką biologii molekularnej umożliwiającą wykrycie konkretnych białek w materiale, który stanowi homogenat tkankowy lub ekstrakt białkowy. Mechanizm działania tego testu opiera się na reakcji antygen-przeciwciało. Pierwszym etapem jest rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS (siarczanu dodecylu sodu) – metodą SDS-PAGE (ang. sodium dodecyle sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). SDS umożliwia rozdział białek ze względu na ich masę cząsteczkową, co odpowiada długości łańcucha polipeptydowego. Dodatek SDS eliminuje efekt rozdziału pod względem kształtu, powoduje on denaturację białek oraz rozbija wiązania niekowalencyjne, co prowadzi do dysocjacji poszczególnych podjednostek. Podczas elektroforezy SDS-PAGE białka o mniejszej masie cząsteczkowej migrują szybciej niż te o większej masie cząsteczkowej. Rozdział prowadzony jest w żelu składającym się z dwóch części – żelu rozdzielającego (znajdującego się na dole) oraz żelu zagęszczającego (położonego na górze), różnią się one gęstością i wartością pH. Białka o niskiej masie cząsteczkowej zawieszone w buforze o niskim przewodnictwie ulegają skondensowaniu na granicy z żelem zagęszczającym. Koncentracja wynika z obustronnego kontaktu z buforami o wysokim przewodnictwie (buforu elektrodowego i buforu w żelu zagęszczającym). Dzięki takiemu umiejscowieniu możliwy jest efektywny rozdział w części rozdzielającej żelu. Kolejnym etapem jest transfer rozdzielonych białek na membranę nitrocelulozową lub PVDF (polifluorek winylidenu). Istnieje kilka dróg przenoszenia produktów rozdziału – transfer kapilarny, próżniowy lub, najczęściej stosowany, elektrotransfer. W tej metodzie wykorzystuje się fakt, że ujemnie naładowane białka migrują w stronę anody, a umieszczając pomiędzy żelem a anodą wspomnianą membranę, dochodzi do zatrzymania na niej produktów elektroforezy. Tak zwaną „kanapkę transferową“ można przygotować na dwa sposoby. Pierwszy z nich nosi nazwę „mokrego“, ponieważ cały układ zanurzony jest w buforze. Drugi, „półmokry“, zakłada umieszczenie „kanapki transferowej“ pomiędzy nasączonymi buforem bibułkami. Ponieważ detekcja białek wiąże się z wykorzystaniem odpowiednich specyficznych przeciwciał należy na wstępie zablokować miejsca niespecyficznego wiązania na membranie. Blokowanie przeprowadza się poprzez zanurzenie membrany w roztworze innego białka np. żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej lub mleka w proszku z dodatkiem detergentu (np. Tween20). W znakowaniu rozdzielonych białek można zastosować dwie metody – bezpośrednią i pośrednią. Metoda bezpośrednia zakłada stosowanie przeciwciał sprzężonych z barwnikiem lub enzymem skierowanych przeciwko poszukiwanym białkom. Metoda pośrednia wiąże się z dwuetapową procedurą. W pierwszym etapie dodaje się przeciwciała przeciwko poszukiwanym białkom (przeciwciała I-rzędowe). W kolejnym etapie dodaje się przeciwciała II-rzędowe skierowanie przeciwko przeciwciałom I-rzędowym, dodatkowo znakowane barwnikiem lub enzymem. Stosowanie enzymu (np. peroksydazy chrzanowej lub fosfatazy alkalicznej) wymaga jeszcze jednego etapu – dodanie do mieszaniny substratu dla enzymu, i w rezultacie reakcji barwnej. Produkt reakcji przedstawia się w postaci prążków. Z uwagi na stosowanie przeciwciał do znakowania produktów reakcji, metodę Western blot nazywa się często Immunoblottingiem. Metoda Western blot znalazła szerokie zastosowanie w diagnostyce medycznej. Rutynowo stosowana jest w diagnostyce zakażenia boreliozą i gruźlicą, a także zakażeń wirusowych, takich jak HIV, koronawirus czy HSV. Znajduje zastosowanie w niektórych chorobach pasożytniczych (wągrzyca) i genetycznych (niedokrwistość Fanconiego).

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest jedną z najczęściej wykorzystywanych metod w badaniach diagnostycznych i naukowych. Podstawowym założeniem tego testu jest reakcja antygen-przeciwciało zachodząca w studzience płytki 96-dołkowej. Istnieje kilka modyfikacji testu ELISA. W celu wykrycia konkretnego białka stosuje się płytki opłaszczone uprzednio przeciwciałami skierowanymi przeciwko poszukiwanemu antygenowi. Następnie należy zablokować możliwość niespecyficznego wiązania do przeciwciał na podłożu stałym. W tym celu inkubuje się płytkę z roztworem albuminy lub odtłuszczonego mleka w proszku. Do tak przygotowanych studzienek dodaje się badaną próbę. Poszukiwane białko podczas inkubacji zostanie wychwycone i związane z przeciwciałem. Po wypłukaniu antygenów, które nie związaly się z fazą stałą płyki dodawane są przeciwciała II-rzędowe skierowane przeciwko badanym białkom, jednak wiążące się w innym miejscu. Przeciwciała II-rzędowe mogą być znakowane chemiluminescencyjnie lub enzymem. W przypadku stosowania enzymu jako znacznika należy przeprowadzić dodatkowy etap reakcji. Polega on na dodaniu substratu do mieszaniny i wystąpienia reakcji barwnej. Najczęsciej stosowane enzymy do znakowania w teście ELISA to peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna i oksydaza glukozowa. Powstały kompleks przeciwciało-antygen-przeciwciało określany jest mianem „kanapki“ a opisana wyżej metoda – „kanapkowym“ testem ELISA.

Z uwagi na wysoką czułość i możliwość uzyskania wyniku ilościowego, test ELISA znajduje szerokie zastosowanie w diagnostyce medycznej. Rutynowo wykorzystywana jest w mikrobiologii lekarskiej i diagnostyce weterynaryjnej, a także badaniach immunologicznych, serologicznych, toksykologicznych oraz onkologicznych.

Mechanizm działania metody immunoturbidymetrycznej i immunonefelometrycznej opiera się na zasadzie, że w precypitującym roztworze kompleks antygen-przeciwciało powoduje jego zmętnienie i w konsekwencji większe rozproszenie wiązki światła niż w przypadku roztworu natywnego. Dzięki założeniu, że natężenie światła rozproszonego jest wprost proporcjonalne do stężenia cząstek rozpraszających, możliwe jest wykorzystanie pomiaru natężenia światła rozproszonego do określenia stężenia antygenu (poszukiwanego białka) w analizowanym roztworze. Metoda immunonefelometryczna polega na pomiarze natężenia światła rozproszonego przez badany roztwór (dektor znajduje się pod kątem 90° w stosunku do wiązki światła), natomiast metoda immunoturbidymetryczna opiera się na pomiarze natężenia światła przechodzącego przez badany roztwór (detektor położony jest na wprost wiązki światła). Kluczowe jest odpowiednie przygotowanie próbki, czyli jej rozcieńczenie. Analiza zbyt gęstego roztworu może prowadzić do uzyskania fałszywie zaniżonych wyników ze względu na powstawanie zbyt wielu kompleksów, co uniemożliwia swobodne przejście wiązki światła. Odczyt wyniku następuje w oparciu o krzywą kalibracyjną. Należy pamiętać, że odczytu wyniku zmętnienia można dokonać jedynie w liniowym zakresie precypitacji według krzywej Heidelberga, czyli przy nadmiarze przeciwciał.

Rutynowo metodą immunonefelometryczną i immunoturbidymetryczną oznacza się stężenia albuminy, składowych dopełniacza C3 i C4, haptoglobiny, ceruloplazminy, transferryny, immunoglobulin IgG, IgM, IgA, łańcuchów lekkich immunoglobulin, β2-mikroglobuliny, apolipoprotein w materiale biologicznym obejmującym właściwie wszystkie płyny ustrojowe człowieka.

Podczas rozważań o metodach oznaczania białka w materiale biologicznym nie sposób pominąć metody wykorzystywanej rutynowo do detekcji białka monoklonalnego – immunofiksacji. Jest to najdokładniejsza technika bazująca nam rozdziale elektroforetycznym stosowana w immunologii. Metoda ta polega na immunoprecypitacji antygenów in situ po rozdziale elektroforetycznym w żelu agarozowym. Badany materiał rozdzielany jest w kilku ścieżkach żelu, tak aby w każdej z nich otrzymać po elektroforezie identyczny rozdział. Nastepnie powierzchnia każdej ze ścieżek (oprócz jednej, która stanowić będzie punkt odniesienia) pokrywana jest przeciwciałem celowanym w konkretną frakcję białka. Dyfundują one w głąb żelu i dochodzi do utworzenia immunoprecypitatów z odpowiednimi antygenami. Po wypłukaniu nadmiaru niezwiązanych przeciwciał żel suszy się i wybarwia. Reakcja barwna ujawni jedynie te białka, które uległy immunofiksacji w wyniku immobilizacji w żelu przez związanie z przeciwciałem. Dowodzi to obecności lub braku) poszukiwanego antygenu w materiale badanym.

Immunofiksacja stosowana jest do identyfikacji i charakterystyki dysprotein oraz patologicznych immunoglobulin. Najbardziej znanym zastosowaniem tej metody w rutynowej diagnostyce jest detekcja białka monoklonalnego u pacjentów ze szpiczakiem mnogim.

Jedną z najnowocześniejszych metod służących do identyfikacji białka są mikromacierze białkowe, zwane również „chipami“ białkowymi. Mikromacierz to płytka o powierzchni kilku centymetrów kwadratowych, na której naniesione są w ściśle określonych miejscach mikroskopijnej wielkości pola, zawierające panel białek, najczęściej przeciwciał skierowanych przeciwko poszukiwanym białkom. Po nałożeniu materiału na płytkę mikromacierzy następuje związanie się białek (o ile występują) z przeciwciałami. Następnie należy dodać na wszystkie pola przeciwciała sprzężone z fluorochromami, które wiążą się do utworzonego w poprzednim etapie kompleksu. Istnieją trzy rodzaje chipów białkowych. Mikromacierze wychwytujące (ang. capture arrays) opierają się na wspomnianej wcześniej reakcji pomiędzy przeciwciałem na płytce i poszukiwanym białkiem. O mikromacierzach odwrotnych (ang. reverse arrays) mówi się, gdy na płytkę naniesiony jest badany lizat białkowy. Pomiar białek następuje po dodaniu wyznakowanych przeciwciał. Ostatnim typem są mikromacierze czynnościowe (ang. functional arrays) umożliwiające badanie interakcji pomiędzy białkami. Wynik ilościowy i jakościowy odczytywany jest przez detektor fluorescencyjny.

Technologia mikromacierzy stała się kluczowym narzędziem dla badań z zakresu proteomiki. Dzięki miniaturyzacji rozmiarów płytki i maksymalizacji wykorzystania powierzchni jest obiecującym narzędziem do diagnostyki białek. Pozwala na szybkie, wydajne i równoległe wykrywnie tysięcy różnych białek na jednej płytce. Mikromacierze mogą również z czasem wkroczyć do rutynowej diagnostyki medycznej ze względu na zmniejszenie ilości potrzebnego materiału klinicznego i wykorzystywanych odczynników. Drugą zaletą jest znaczne przyspieszenie całego procesu analitycznego co jest szczególnie ważne w diagnostyce laboratoryjnej materiału pochodzącego od pacjentów. Istotny jest również fakt, że niewielki chip białkowy może jednocześnie odpowiedzieć na tysiące pytań dotyczacych stanu zdrowia pacjenta.

Obecnie dostępne są już mikromacierze wykrywające jednocześnie przeciwciała przeciwko różnym antygenom HIV-1, HIV-2 oraz wirusów zapalenia wątroby. Znajdują także zastosowanie w identyfikacji markerów nowotworowych.

 

Spektrometria mas (MS, ang. mass spectrometry) jest zaawansowaną techniką analityczną, która pod kątem badań proteomicznych pozwala na identyfikację białek w złożonych próbkach materiału biologcznego, ilościową ocenę ich ekspresji, mas cząsteczkowych oraz ustalenie składu aminokwasowego. Analiza białek przy użyciu MS polega na jonizacji cząsteczek w stanie gazowym i następnie ich rozdzieleniu w zależności stosunku masy do. ładunku elektrycznego. Prowadzi to do powstania widma masowego, które jest podstawą do identyfikacji poszukiwanego białka. W proteomice najczęściej wykorzystywane są dwie modyfikacje elementu budowy MS - jonizatora: MALDI (ang. matixassisted laser desorption/ionization) czyli desorpcja laserowa z udziałem matrycy oraz ESI (ang. electrospray ionization) czyli elektrorozpylanie Również wśród analizatorów mas można spotkać wiele modyfikacji. Obecnie najpopularniejszym w badaniach nad proteogramem jest analizator czasu przelotu (TOF, ang. time of flight) w połączeniu z jonizatorem MALDI. TOF pozwala na badanie czasu przelotu jonów między jonizatorem a detektorem, który zależy od wartości stosunku masy do liczby ładunków jonów. Niewątpliwie największą zaletą stosowania modyfikacji MALDI-TOF jest bezpośrednia detekcja składu złożonej mieszaniny białek lub innych cząsteczek.

W dziedzinie proteomiki MALDI-TOF znajduje zastosowanie w identyfikacji białek w złożonym, heterogennym materiale biologicznym, wyznaczaniu mas cząsteczkowych oraz wykrywania modyfikacji potranslacyjnych białek.

PIŚMIENNICTWO:

1.    Opiela J.: Analiza ekspresji genów na poziomie białek przy użyciu techniki western-blot. Wiadomości zootechniczne, R. XLIV (2006); 1: 11-13.

2.    Wu W., Welsh M.J., Kaufman P.B., Zhang H.H.: Analysis of gene expression at the proteomic level. Gene Biotechnology 2004; CRC Press.

3.    Lequin R (2005), Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Clin. Chem. 51 (12): 2415–8.

4.    S. Leng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel (October 2008). Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): 879–84.

5.    Torane VP, Shastri JS; Comparison of ELISA and rapid screening tests for the diagnosis of HIV, hepatitis B and hepatitis C among healthy blood donors in a tertiary care hospital in Mumbai; Indian Journal of Medical Microbiology; 2008; 26(3).

6.    Chan EL, Sidaway F, Horsman GB: A comparison of the Genie and western blot assays in confirmatory testing for HIV-1 antibody. Journal of Medical Microbiology; 03.1996.

7.    Uttamchandani M, Neo JL, Ong BNZ, Moochhala S; Applications of microarrays in pathogen detection and biodefence; Trends in Biotechnology. 2008;53(27):61.

8.    Haab BB.,Dunham MJ., Brown PO.: Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biol. 2001;2:1-13.

9.    Krzemiński Z.: Postępy w diagnostyce mikrobiologicznej chorob zakaźnych. Przegl Epidemiol 2003;57: 377-80.

10.    Mahmood T., Yang PC.:Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012;4(9):429-34.

11.    Chandra H., Reddy PJ., Srivastava S.: Protein microarrays and novel detection platforms. Expert Rev Proteomics. 2011 Feb;8(1):61-79.

12.    Wieser A., Schneider L., Jung J., Schubert S.: MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 Feb;93(3):965-74.

13.    Litwin CM., Anderson SK., Philipps G., Martins TB., Jaskowski TD., Hill HR.: Comparison of capillary zone and immunosubtraction with agarose gel and immunofixation electrophoresis for detecting and identifying monoclonal gammopathies. Am J Clin Pathol. 1999 Sep;112(3) 411-7.

Maciej Jaśkiewicz

Gdański Uniwersytet Medyczny
strony wersji drukowanej: 35-41




Białka odgrywają jedną z najważniejszych ról we wszystkich procesach biologicznych, pełniąc istotne funkcje zarówno u organizmów jednokomórkowych jak i wysoce zorganizowanych układów u zwierząt. Odpowiadają one między innymi za transport i magazynowanie substancji odżywczych, wzrost i różnicowanie, przemiany wewnątrzkomórkowe, a także ochronę immunologiczną. Różnorodność funkcjonalna białek determinowana jest mnogością struktur przestrzennych jakie mogą one przyjmować (funkcja białek jest następstwem ich struktury). Z chemicznego punktu widzenia białka to złożone makrocząsteczkowe polimery zbudowane z aminokwasów połączonych kowalencyjnie wiązaniami peptydowymi. Każda cząsteczka białka ma dokładnie zdefiniowaną ilość podstawowych jednostek strukturalnych, aminokwasów, a także dokładnie określoną ich liniową kolejność. Co więcej, duża część białek w konsekwencji modyfikacji potranslacyjnych może nabyć nowych cech strukturalnych oraz funkcjonalnych.

Większość białek w organizmie ludzkim to białka wewnątrzkomórkowe, a poziom ich ekspresji jest zróżnicowany w zależności od komórek/tkanek, w których występują. Następnie wydzielane są do osocza i płynu śródmiąższowego, gdzie zaczynają pełnić swoją funkcję (do 95% ogólnej liczby białek osocza ma pierwotną lokalizację wewnątrz-komórkową). Pula białek krążących może się zmieniać wraz z wiekiem, a także w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych. W związku z powyższym w wielu przypadkach stanowią one doskonały laboratoryjny wskaźnik stanu zdrowia, co może pozwolić na wczesne wdrożenie odpowiedniego leczenia.

Osocze jest płynem, które pozostaje w kontakcie z komórkami wszystkich tkanek organizmu. Stanowi ono płynne środowisko krwi pełniąc funkcje transportowe oraz komunikacyjne. Przenosi ono do tkanek substancje niezbędne do życia komórek jednocześnie usuwając z przestrzeni śródtkankowej końcowe produkty metabolizmu. W osoczu ludzkim istnieje około 700 białek. Każde z nich posiada kilka mas cząsteczkowych, co wynika zarówno z koegzystencji form prekursorowych, dojrzałych, degradowanych czy też wariantów modyfikacji potranslacyjnych. Sumarycznie daje to kilkadziesiąt tysięcy form molekularnych klasycznych białek osocza. Stosunkowo niewielka ilość tych białek jest oznaczana zarówno do celów podstawowej jak i wysoce wyspecjalizowanej diagnostyki laboratoryjnej. Białka, ze względu na miejsce syntezy oraz funkcję, można podzielić na szereg grup (tab. 1).

Białka występujące w osoczu wykazują znaczną różnorodność pod względem liczebności i pełnionej funkcji. Odpowiadają one między innymi za:

1. Ciśnienie onkotyczne – jest to rodzaj ciśnienia osmotycznego, utrzymywanego przez białka obecne w krwi (głównie albuminy). Ciśnienie to równoważy ciśnienie hydrostatyczne krwi w naczyniach krwionośnych (wynoszące ok. 30 mmHg). Pozwala to na utrzymanie odpowiedniej objętości osocza w krwioobiegu. W sytuacjach patologicznych, w których następuje znaczne obniżenie poziomu białek osocza (białkomocz, niedożywienie) dochodzi do obniżenia ciśnienia onkotycznego, co prowadzić może do powstania obrzęku.

2. Funkcje transportowe - głównym białkiem transportowym osocza jest albumina. Dzięki zawartości aminokwasów dwukarboksylowych oraz wysokiemu stężeniu stanowi układ o dużej pojemności wiążącej. Pozostałe białka transportowe, których stężenie jest co najmniej dziesięciokrotnie niższe od albuminy, pełnią funkcję transporterów specyficznych. Wykazują one powinowactwo do ściśle określonych substancji biologicznie czynnych. Co więcej, również niektóre hormony posiadają swoje białka transportowe.

3. Aktywność regulatorowa lub enzymatyczna – jedną z ważniejszych ról białek stanowi ich zdolność do katalizy specyficznych reakcji chemicznych zachodzących w organizmie. Pośród nich możemy wymienić enzymy będące zarówno inhibitorami jak i aktywatorami w układzie krzepnięcia, w metabolizmie lipoprotein/lipidów, oksydoreduktazy jak np. ceruloplazmina katalizująca utlenienie Fe²⁺ do Fe³⁺ (umożliwiając wiązanie z transferyną). Ponadto wymienić można też proteazy takie jak renina i konwertaza angiotensyny powodujące odczepienie mało aktywnego dekapeptydu – angiotensyny I od angiotensynogenu, a następnie jej proteolityczną konwersję do aktywnej biologicznie angiotensyny II (oktapeptyd, będący jednym z najbardziej efektywnych regulatorów ciśnienia krwi). W praktyce klinicznej duże znaczenie odgrywają enzymy pierwotnie wewnątrzkomórkowe, takie jak aminotransferazy alaninowa (ALAT) i aspraginowa (AspAT), kinaza kreatynowa, fosfataza kwaśna i zasadowa czy też elastaza 3B. Aktywność oraz ilość tych enzymów wzrasta wskutek uwalniania z uszkodzonych/obumierających lub zmienionych zapalnie komórek.

4. Układ odpornościowy – niezwykle istotną rolą białek jest ich udział w reakcjach odpornościowych organizmu. Duża część stanowiąca układ dopełniacza posiada zdolność do tworzenia cząstek atakujących błony (element odporności nieswoistej). Natomiast aktywne limfocyty B posiadają zdolność wytwarzania różnych klas przeciwciał (immunoglobulin). Komórki te pod wpływem różnych antygenów tworzą odrębne linie (klony) komórkowe, z których każda produkuje specyficzne przeciwciało. U dorosłego człowieka istnieje kilkadziesiąt tysięcy specyficznych przeciwciał powstających na skutek ekspozycji na różne egzogenne antygeny. W tym wypadku mówimy o odporności swoistej.

Ilość białek w osoczu, ze względu na rolę jaką odgrywają, niejednokrotnie odzwierciedla zaburzenia funkcji narządów uczestniczących w utrzymaniu homeostazy organizmu. Nieprawidłowa czynność wątroby, nerek, układu odpornościowego, choroby nowotworowe a nawet niedożywienie objawiają się zmianami stężenia białek, tym samym oznaczenie ich ilości stanowi doskonałe narzędzie w diagnostyce klinicznej.

Obniżone stężenie białka (hipoproteinemia) występuje znacznie częściej niż jego wzrost i na ogół jest wynikiem hipoalbuminemii. Stan ten dotyczy pacjentów dotkniętych zespołem nerczycowym, bądź też chorych ze schyłkową marskością wątroby. Do przyczyn hiperproteinemii należą przede wszystkim: odwodnienie, obecność przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych, a także przewlekły stan zapalny. Postawienie prawidłowej diagnozy, tym samym wdrożenie stosownego leczenia związane jest z uzyskaniem wiarygodnych wyników. Niejednokrotnie decydujące w tym wypadku jest wdrażanie odpowiednich procedur związanych z pobraniem próbek, a także przygotowaniem pacjenta. Na stężenie białka wpływają między innymi warunki pobrania krwi. Pionizacja ciała powoduje jej zagęszczenie o ok. 10%, wysiłek fizyczny może skutkować wzrostem stężenia białka o kolejne 10% (w przypadku AspAT i ALAT nawet do 40%), natomiast u pacjenta leżącego (w wyniku rozcieńczenia krwi) możemy mówić o stężeniu o 7-15% niższym. Należy mieć również na uwadze wpływ błędów trywialnych takich jak zbyt długi ucisk stazy (powodujący ucieczkę wody do tkanek i zagęszczenie pobranej do badań krwi). By wyeliminować wpływ warunków zewnętrznych (w szczególności u pacjentów ambulatoryjnych) należy przed pobraniem krwi stosować około półgodzinny odpoczynek w pozycji siedzącej.

Białko osocza stanowi niejednorodną mieszaninę białek funkcjonalnych, charakteryzujących się różną budową i właściwościami. W związku z powyższym, ocena ilościowa białka całkowitego osocza stanowi nie lada problem, ponieważ nie ma układu odniesienia do oceny tego rodzaju mieszaniny niejednorodnej. W klasycznej analizie biochemicznej podstawą do oceny białka jest ilość azotu związanego w jego masie. Jako wzorzec przyjmuje się cząsteczki albuminy wołowej po precypitacji kwasem trójchlorocotowym (TCA). W tym wypadku, azot związany z białkiem można przeliczyć na masę białka (g) mnożąc przez współczynnik 6,25.

Referencyjną metodą oznaczania azotu białkowego jest metoda wolumetryczna Kjeldahla. Obecnie stosuje się metody kolorymetryczne. Pierwszą z nich jest metoda biuretowa. Wiązania peptydowe obecne w białkach reagują z jonami Cu2+ w roztworze alkalicznym dając barwny produkt, którego absorbancję mierzy się spektrofotometrycznie (długość fali 546 nm). Intensywność powstałego zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości wiązań peptydowych. W metodzie tej, z zastosowanym odczynnikiem nie reagują zarówno aminokwasy jak i peptydy. Tripeptydy, oligopeptydy i polipeptydy natomiast reagują dając zabarwienie od różowego do fioletowego. Na podobnej zasadzie tworzenia barwnych kompleksów z atomami azotu wiązań peptydowych i różnymi resztami aminokwasowymi oparte zostały inne metody kolorymetryczne (Tabela 5). W metodach Lowry’ego – Rosenbaum czy też Folina–Ciocalteu wykorzystany został fakt redukcji kwasów fosforomolibdenowego i fosforowolframowego przez zawarte w białkach aminokwasy aromatyczne: tyrozynę i tryptofan. Obie reakcje przebiegają również w środowisku zasadowym, a intensywność powstałego zabarwienia zależy od rodzaju oznaczanego białka (wynika to przede wszystkim od zawartości ww. aminokwasów). Mimo wysokiej czułości tych metod ograniczeniem jest dość niska swoistość, ponieważ wolna tyrozyna, tryptofan, kwas moczowy, a także pochodne puryny i pirymidyny mogą dawać reakcję dodatnią z odczynnikiem.

W bezpośredniej metodzie spektrofotometrycznej wykorzystany został fakt absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez białka w zakresie UV (200-225 nm oraz 270-290 nm). Zwykle stosowana jest długość fali równa 280 nm. Absorpcja zależna jest od zawartości aminokwasów aromatycznych (tyrozyny i tryptofanu). Dlatego też, tak jak w metodach kolorymetrycznych, ograniczenie stanowi obecność wolnych aminokwasów w badanej próbce. Ponadto, bilirubina i kwas moczowy również absorbują promieniowanie przy 280 nm.

W sytuacji, gdy konieczne jest szybkie oszacowanie zawartości białka, zastosowanie znajduje metoda refraktometryczna. Wówczas oznaczenie białka wykonuje się na podstawie współczynnika załamania światła. Wyniki uzyskane tą metodą są nieprawidłowe w sytuacji, gdy stężenie białka całkowitego jest niższe od 3,5g/dL. W przypadku, gdy wynosi ono powyżej 11 g/dL, badaną próbkę należy rozcieńczyć wodą destylowaną.

W celu dokładnej oceny ilościowej i jakościowej poszczególnych białek wykonywany jest proteinogram. Podstawową techniką pozwalającą na jego otrzymanie jest elektroforeza żelowa. W metodzie tej wykorzystywane jest zjawisko wędrowania białek w stałym polu elektrycznym. Poszczególne frakcje poruszają się z różną prędkością i ulegają rozdziałowi. Obecnie stosowane metody wykorzystują różne rodzaje podłoża i bufory o zasadowym pH. W takim środowisku większość białek wędruje w kierunku anody (albumina i α-globuliny). Białka zasadowe (γ-globuliny) zostają bliżej katody. Proteinogram pozwala na wyszczególnienie pięciu podstawowych grup białek: albumin, α1-globulin, α2-globulin, β-globulin i γ-globulin. Wykonując rozdział elektroforetyczny białek osocza obserwuje się również obecność fibrynogenu, który lokalizuje się między frakcją β oraz γ. Odchylenia od normy polegają na zmianach ilościowych i udziale procentowym poszczególnych białek w proteinogramie. By uzyskać wynik ilościowy dokonuje się odczytu densytometrycznego rozdziału elektroforetycznego.

Zmiany w puli białek niejednokrotnie mogą znajdować odzwierciedlenie w innych parametrach diagnostycznych. Przykładem jest pomiar szybkości opadania erytrocytów (krwinek czerwonych) zwany inaczej Odczynem Biernackiego (OB). Krwinki u osoby zdrowej opadają powoli (ich błony komórkowe są ujemnie naładowane – działają na nie siły wzajemnego odpychania). Białka krwi, w szczególności fibrynogen, łączy się z ujemnie naładowanymi błonami, neutralizując ich ładunek, promując adherencję, rulonizację przyspieszając jednocześnie ich opadanie. Test ten pozwala na ocenę zaburzeń proporcji pomiędzy stężeniami poszczególnych białek osocza i właściwościami erytrocytów.

W niniejszym artykule opisana została tylko po części rola jaką odgrywają białka w naszym organizmie, a także niektóre z podstawowych metod ich oznaczania. Wraz z rozwojem technik immunologicznych czy też analitycznych zakres prowadzonych badań uległ znacznemu rozszerzeniu, pozwalając z dużą dokładnością ocenić ilość konkretnych białek, a także całego spektrum białkowego w różnych rodzajach materiałów biologicznych. Coraz większe znaczenie odgrywa ocena unikalnych konfiguracji kilkudziesięciu lub kilkuset białek jednocześnie. Proteomika jest dziedziną nauki, zajmującą się równoczesną analizą mieszanin białkowych o złożonym składzie (np. lizatów komorkowych czy ekstraktów z homogenatów tkankowych). Analiza proteomiczna pozwala na ilościowe oznaczenie syntetyzowanego na matrycy mRNA białka, a także jego potranslacyjne modyfikacje. Zmiany te niejednokrotnie decydują o ich funkcji wewnątrz ustroju. Mając na uwadze hipotezę, iż „życie jest formą istnienia substancji białkowych” – analiza szerokiego profilu białkowego może pozwolić na określenie parametrów funkcjonowania całego organizmu.

PIŚMIENNICTWO:

1. A. Dubin: Wprowadzenie do chemii białek. Wydział biotechnologii UJ. Kraków, 2003.

2. B. Neumeister, I. Besenthal, B.O. Böhm: Diagnostyka laboratoryjna. wyd. II polskie, red. M. Pietruczuk, A. Bartoszko-Tyczkowska. Elsevier Urban & Partner. Wrocław, 2013.

3. A. Dembińska-Kieć, J.W. Naskalski: Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Elsevier Urban & Partner. Wrocław, 2009.

4. A. Szutowicz, A. Raszeja-Specht: Diagnostyka laboratoryjna, Tom II, Gdański Uniwersytet Medyczny. Gdańsk, 2011.

Emilia A. Lubecka

Podczas poszukiwania efektywniejszych leków syntezuje się setki, a nawet tysiące nowych związków chemicznych, a następnie analizuje się ich aktywność. Jest to bardzo kosztowny i czasochłonny proces. Obecnie chemia to nie tylko praca w laboratorium nad skomplikowaną aparaturą i z drogimi a często nawet szkodliwymi odczynnikami chemicznymi. Nowoczesne projektowanie leków tzw. „drug-design”, gdzie z powodzeniem wykorzystywana jest chemia teoretyczna, obejmuje również badania nad zależnością struktura-aktywność. Podejście to prowadzi do wyselekcjonowania potencjalnie najlepszych kandydatów na nowy lek - ograniczenia puli rozważanych modyfikacji strukturalnych. Efektem tego jest redukcja kosztów i przyspieszenie w poszukiwaniu bardziej aktywnych i/lub selektywnych leków o oczekiwanych właściwościach fizyko-chemicznych.

Struktura aktywna cząsteczki w roztworze może zostać określona przy zastosowaniu spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Do badań konformacyjnych zastosowanie znajdują także metody chemii obliczeniowej.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Nuclear Magnetic Resonance, NMR) jest jedyną metodą spektralną, która umożliwia pełne poznanie struktury przestrzennej na poziomie atomowym oraz określenie dynamiki badanych biomolekuł w roztworze. W wyniku wprowadzenia technik wielowymiarowego NMR oraz nowych metod obliczeniowych, można obecnie ustalać struktury przestrzenne z dokładnością porównywalną do wyników otrzymywanych na drodze badań rentgenowskich. Ponadto, stosując odpowiednie roztwory, można zapewnić in vitro środowisko zbliżone do warunków natywnych w komórce. Z powyższych względów spektroskopia NMR znajduje szerokie zastosowanie m.in. w monitorowaniu przebiegu procesów biochemicznych; określaniu fragmentów biomolekuł kluczowych dla ich aktywności oraz poszukiwaniu nowych, aktywniejszych leków. Znalazła ona zastosowanie w wielu różnych dziedzinach: od określania struktury chemicznej materii do obrazowania żywych tkanek i całych organizmów.

Istotę spektroskopii NMR stanowi rejestracja sygnałów powstałych wskutek absorbcji promieniowania elektromagnetycznego o częstościach radiowych przez zbiór jąder umieszczonych w polu magnetycznym. Jądra te muszą być magnetycznie czynne, tj. obdarzone spinami i związanymi z nimi momentami magnetycznymi. Najczęściej wykorzystywane są następujące izotopy: ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P oraz ¹⁹F. Częstość promieniowania zaabsorbowanego przez dane jądro atomowe jest ściśle zależna od jego typu oraz rozkładu gęstości elektronowej wokół niego – a tym samym od struktury cząsteczki. W efekcie tego, sygnały pochodzące od poszczególnych jąder atomowych badanych cząsteczek charakteryzują się określonym położeniem na widmie. Intensywności tych sygnałów są wprost proporcjonalne do ilości jąder atomowych danego typu. Do określenia położenia sygnału na widmie NMR stosuje się bezwymiarową wielkość zwaną przesunięciem chemicznym δ, której jednostką jest ppm (ang. parts per milion, części na milion). Wyznacza się ją względem przesunięcia chemicznego jąder substancji wzorcowej, w spektroskopii ¹H oraz ¹³C NMR zazwyczaj jest to tetrametylosilan (TMS).

Największe znaczenie spośród metod NMR zyskał magnetyczny rezonans protonowy (¹H), ze względu na to, że widoczny w spektroskopii NMR proton jest najbardziej rozpowszechnionym (99,98%) izotopem wodoru, co ułatwia rejestrację widm 1H NMR. Dużą popularnością cieszy się również spektroskopia NMR atomów węgla (¹³C), azotu (¹⁵N) oraz fosforu (³¹P).

W zależności od tego co jest przedmiotem badań stosowane są różne techniki NMR. Natomiast podstawowe dane uzyskiwane z widm NMR, na podstawie których dokonuje się analizy strukturalnej biomolekuł, są zawsze te same: przesunięcia chemiczne; stałe sprzężenia oraz wielkości jądrowego efektu Overhausera (tzw. kontakty NOE).

Rys. 1. Przykładowe dwuwymiarowe widmo NMR - widmo NOESY desmopresyny.

W celu przeanalizowania peptydów i niewielkich białek stosuje się klasyczne techniki NMR, opracowane w latach 80-tych XX wieku przez laureata Nagrody Nobla Kurta Wüthricha. Niewielka liczba reszt aminokwasowych - a tym samym niewiele sygnałów na widmach NMR tych związków - sprawia, że nie obserwuje się nakładania sygnałów lub nakładanie to występuje w niewielkim zakresie, z powodzeniem więc można przypisać wystarczającą do analizy strukturalnej liczbę sygnałów bazując na widmach jedno- (1D) oraz dwu- (2D) wymiarowych.

Analizowanie widm NMR peptydów składa się z następujących etapów:

analiza sekwencyjna oraz identyfikacja linii rezonansowych poszczególnych reszt aminokwasowych - uzyskanie informacji o przesunięciach chemicznych atomów wodorów dla poszczególnych reszt aminokwasowych w sekwencji;

uzyskanie informacji o odległościach międzyprotonowych w badanej cząsteczce;

uzyskanie informacji dodatkowych, np.: odczytanie stałych sprzężenia, wyznaczenie współczynników temperaturowych, określenie wartości przesunięć chemicznych węgli itp.

Ogólny schemat procedury oraz techniki NMR wykorzystywane w analizie peptydów przedstawiono na Rysunku 2.

RYS 2

Pewne przesłanki na temat struktury drugorzędowej danych fragmentów peptydów można uzyskać bezpośrednio na podstawie obserwacji kontaktów NOE oraz analizy wartości stałych sprzężenia. Jednakże, do uzyskania pełnego obrazu struktury przestrzennej niezbędne są metody obliczeniowe uwzględniające dane NMR, np. modelowanie molekularne.

Klasyczne techniki NMR, omówione powyżej, nie sprawdzają się w przypadku dużych biomolekuł, ze względu na nakładanie się licznych sygnałów na widmach, co uniemożliwia ich jednoznaczną identyfikację. Dla białek o masie powyżej 10 kDa, stosuje się widma trój- (3D), cztero- (4D) a nawet pięcio- (5D) czy siedmiowymiarowe (7D), co poprawia rozdzielczość i znacząco zwiększa prawdopodobieństwo rozseparowania poszczególnych sygnałów. Wzrost liczby wymiarów widm NMR, poza zwiększeniem liczby korelowanych jąder (a tym samym większą ilością otrzymywanych danych), niesie ze sobą także znaczny wzrost czasu/kosztu pomiaru. Problem ten został częściowo rozwiązany przez wprowadzenie w ostatnich latach nowych metod transformacji widm. Przykładowo transformacji Fouriera z losowym próbkowaniem (ang. random sampling) przestrzeni czasów ewolucji (ang. evolution time space). Wielowymiarowe techniki NMR wymagają również próbek znakowanych izotopowo – co dodatkowo zwiększa koszty.

Na analizę widm NMR białek, ogólnie ujmując, składają się następujące etapy: analiza sekwencyjna, przypisanie łańcuchów bocznych oraz wyznaczenie odległości międzyprotonowych. Poniżej na rysunku 3 przedstawiono popularniejsze techniki NMR wykorzystywane w badaniach białek w roztworze.

RYS 3

Strukturę przestrzenną białek można wyznaczyć przy użyciu bardzo wielu programów. Część z tych programów bazuje na odległościach pomiędzy protonami (uzyskanymi z kontaktów NOE) np. program CYANA. Inne natomiast już na podstawie sekwencji i zbioru przesunięć chemicznych potrafią wstępnie określić strukturę drugorzędową białka, np. program TALOS+ czy CS23D (ang. Chemical Shift to 3D structure). Do uzyskania pełnej struktury przestrzennej, tak jak w przypadku peptydów, stosuje się metody chemii obliczeniowej.

Metody obliczeniowe

Poznanie struktury peptydu czy białka jest konieczne do zrozumienia jego właściwości fizycznych, chemicznych a także biologicznych. Dane uzyskane z eksperymentu często nie są wystarczające i wymagają weryfikacji metodami obliczeniowymi.

Tworzenie modelu

Przeprowadzanie symulacji komputerowych zawsze należy poprzedzić stworzeniem modelu układu, który chcemy analizować. Dostępne programy posiadają szerokie bazy danych związków chemicznych, które możemy wykorzystać. Długości wiązań, wartości kątów walencyjnych i torsyjnych, ładunki cząstkowe oraz inne parametry charakterystyczne dla budowy poszczególnych związków chemicznych zostały opracowane na podstawie danych eksperymentalnych. W przypadku gdy nie znajdziemy jakiejś substancji, możemy sami dokonać jej parametryzacji i dodać ją do tworzonego przez nas modelu. Możemy stworzyć model samego peptydu, cukru czy wielkocząsteczkowego białka lub większego układu np. biomolekuła - rozpuszczalnik.

Badaniom poddaje się także znacznie większe i bardziej skomplikowane układy, jak np. peptydy czy białka w obecności błony komórkowej, gdyż błony biologiczne odgrywają istotną rolę w stabilizacji struktury oraz w znacznej mierze determinują funkcje znajdujących się w nich białek. Ponadto hormony peptydowe prawdopodobnie wiążą się niespecyficznie z błoną lipidową, przybierając orientację oraz konformację umożliwiającą związanie się z receptorami błonowymi. W związku z modelem dwuetapowego transportu liganda do receptora, istotne jest znalezienie konformacji peptydu w środowisku imitującym błonę komórkową. Ze względu na powyższe, badania konformacyjne często przeprowadza się w układach imitujących środowisko błony komórkowej (Rys. 4). Nie stanowi to problemu dla chemii obliczeniowej. Możemy stworzyć model bardzo skomplikowanego układu i go przeanalizować zanim zdecydujemy się na zakup drogich odczynników chemicznych czy zaplanujemy kolejne eksperymenty.

RYS 4

do receptora, istotne jest znalezienie konformacji peptydu w środowisku imitującym błonę komórkową. Ze względu na powyższe, badania konformacyjne często przeprowadza się w układach imitujących środowisko błony komórkowej (Rys. 4). Nie stanowi to problemu dla chemii obliczeniowej. Możemy stworzyć model bardzo skomplikowanego układu i go przeanalizować zanim zdecydujemy się na zakup drogich odczynników chemicznych czy zaplanujemy kolejne eksperymenty.

Dynamika molekularna

Metoda dynamiki molekularnej (ang. Molecular Dynamics, MD) służy do badania ewolucji czasowej układu molekularnego złożonego z oddziałujących ze sobą w pewnej objętości cząstek. Współczesna chemia obliczeniowa dostarcza wiele pól siłowych umożliwiających analizę zbioru cząsteczek w czasie, takich jak np.: AMBER (ang. Assisted Model Building with Energy Refinement), CHARMM (ang. Chemistry at Harvard Molecular Mechanics) czy ECEPP (ang. Empirical Conformational Energy Program for Peptides). Opisują one hiperpowierzchnię energii potencjalnej układu jako sumę energii oddziaływań pomiędzy poszczególnymi atomami w funkcji współrzędnych tych atomów. Głównym założeniem pól siłowych jest to, że wszystkie oddziaływania pomiędzy atomami są addytywne i niezależne. Pozwala to na przybliżenie energii potencjalnej układu jako sumy energii oddziaływań pomiędzy wszystkimi atomami.

Symulację dynamiki molekularnej przeprowadza się zazwyczaj w dwóch etapach. Pierwszy etap służy ustabilizowaniu układu - uzyskania najbardziej prawdopodobnej konfiguracji badanej cząsteczki w danych warunkach (temperatury, ciśnienia). Uznaje się, że układ osiągnął stan równowagi gdy wartości odpowiednich wielkości termodynamicznych wahają się wokół wartości średnich, które są stałe w czasie. Drugi etap MD polega na zbieraniu danych w różnych warunkach pomiaru. Finalnie otrzymujemy zbiór konformacji, które ze względu na obecność naprężeń atomowych poddaje się następnie minimalizacji energii. Głównym celem minimalizacji jest likwidacja tych naprężeń oraz optymalizacja geometrii badanych układów. Minimalizacja wyszukuje takie położenie atomów, które będzie reprezentować minimum energii potencjalnej systemu. Strukturę przykładowego białka po symulacji MD zamieszczono na rysunku 5.

RYS 5

Określając geometrię badanej cząsteczki metodą MD możemy wykorzystać dane NMR nakładając więzy strukturalne ograniczające ruch danych atomów podczas symulacji. Bardzo często stosuje się procedurę dodawania więzów uśrednionych po danym oknie czasowym (ang. Time-Averaged Restraints, TAV). Takie podejście uwzględnia występowanie badanej cząsteczki w wielu konformacjach będących w równowadze w roztworze, ponieważ odległości międzyatomowe oraz kąty torsyjne są liczone jako wartości średnie w danym oknie czasowym, a nie tylko jako wielkości odpowiadające jednej wybranej konformacji. Dane NMR można wykorzystać również w trakcie analizy i selekcji wynikowych struktur. Najbardziej prawdopodobne są te struktury, które najlepiej odzwierciedlają wyniki eksperymentalne.

Wyznaczenie konformacji badanej biomolekuły na podstawie danych NMR można również sprowadzić do rachunkowego określania struktury poprzez nałożenie więzów na odległości międzyatomowe metodą geometrii odległościowej (ang. Distance Geometry, DG).

Analiza oddziaływań ligand-receptor

Oddziaływania białek z ich ligandami pełnią kluczową rolę w ogromnej ilości procesów biologicznych, a w szczególności w procesach przekazywania sygnału. Dlatego odnalezienie i poprawne zdefiniowanie miejsc na powierzchni lub wewnątrz struktury białka odpowiedzialnych za interakcje z ligandami jest niezwykle istotne. Z tego względu opracowano specjalne programy, które służą do szczegółowej analizy oddziaływań ligand-receptor. Jednym z takich programów „do dokowania” jest program AutoDock.

AutoDock umożliwia zadeklarowanie przestrzeni białka, w której będzie poszukiwał miejsc potencjalnie odpowiedzialnych za wiązanie liganda. Wykorzystuje się w tym celu wprowadzone przez użytkownika dane eksperymentalne dotyczące przybliżonego obszaru wiązania się liganda do receptora. Następnie oblicza mapę powinowactwa atomowego dla każdego atomu w zadeklarowanej przestrzeni dokowania. Mapa ta jest rozpięta na siatce punktów w przestrzeni, w której zostaje umieszczony próbny atom, a potem liczona jest energia oddziaływania pomiędzy białkiem a próbnym atomem.

Program AutoDock generuje dużą liczbę zróżnicowanych konformacyjnie układów sparametryzowanego ligandu w kieszeni wiążącej zamodelowanego receptora. Wybór finalnych konformacji należy do użytkownika i powinien być oparty na wnikliwej analizie dostępnych danych eksperymentalnych. Ponadto ze względu na zastosowane w nim ubogie pole siłowe, otrzymane kompleksy charakteryzują się dużą energią o niewiarygodnym rozkładzie i z tego względu muszą być optymalizowane (np. metodą minimalizacji energii).

W celu określenia zachowania białka receptorowego, jak i identyfikacji reszt receptora potencjalnie zaangażowanych w wiązanie liganda analizuje się zmiany konformacji ligandów podczas symulacji. Otrzymane wyniki mogą zostać wykorzystane m. in. do wskazania potencjalnie istotnych konformerów, mogących być punktem wyjścia w projektowaniu analogicznych związków o znaczeniu farmakologicznym.

W badaniach konformacyjnych dotyczących struktury przestrzennej peptydów i białek istotne jest równoczesne użycie wielu technik badawczych, zarówno doświadczalnych jak i teoretycznych, oraz zestawienie ze sobą uzyskanych różnymi technikami wyników. Pozwala to na dokładne ustalenie struktury przestrzennej biomolekuł i ich dynamiki oraz określenie wpływu geometrii cząsteczki na właściwości biologiczne badanych peptydów czy białek.

Chemia teoretyczna nigdy nie zastąpi eksperymentu, ale może go efektywnie wspomóc ograniczając pulę rozważanych modyfikacji strukturalnych badanych molekuł czy eksperymentów do przeprowadzenia. Może również rzucić światło na przebieg procesów biochemicznych, których na dzień dzisiejszy analiza nie jest możliwa drogą eksperymentalną.

PIŚMIENNICTWO

1.    Ejchart A. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w wyznaczaniu budowy białek. Kosm Probl Nauk Biol. 2004;53:263–270.

2.    Forster M. J., Molecular modelling in structural biology. 2002, Micron, 33:365-384.

3.    Jacobsen NE. NMR Spectroscopy explained: Simplified Theory, Applications and Examples for Organic Chemistry and Structural Biology. England: Wiley; 2007.

4.    Lubecka E.A., Sikorska E. Techniki megnetycznego rezonansu jądrowego w analizie konformacyjnej peptydów i białek . Dokonania Młodych Naukowców. 2014, pod red. M. Kuczera, K. Piech , Creativetime. 5:34-39.

5.    Wiórkiewicz-Kuczera J. Metody Pola Sił. Zastosowania w Badaniach Konformacji Układów Biologicznych. Zagadnienia Biofizyki Współczesnej. 1984;9:55–124.